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          技術資料

          流式細胞術知識分享 — 數據分析篇

          在前幾期的流式細胞術知識分享中,我們為大家介紹了儀器、試劑以及應用方面的知識。今天,我們將介紹最后一部分——數據分析。

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          目前,傳統的雙參數直方圖(點狀圖)“門控”分析方法仍然被頻繁使用。但隨著流式細胞術實驗的參數和復雜性的增加,新的聚類數據分析方法得到使用,比如PCA、SPADE以及tSNE等,這些新的數據分析方法使研究者能夠從流式細胞術高維數據中提取有用的信息。


          FCS文件標準

          FCS文件格式創建于1984年,用于標準化流式細胞術列表模式數據文件。所有流式細胞術數據文件都有“.fcs”文件擴展名,以被任何的流式細胞術分析程序讀取。目前,FCS文件標準是FCS 3.1。


          常規流式細胞術分析

          常規的流式細胞術分析,即選定目標細胞群所在區域(門控),并根據實驗需要,選擇參數對選定的細胞群進行分析。例如,輔助T細胞群先根據CD3+、CD4+的表達被選定。之后,再根據活化標記物(比如CD25)的表達選定活化細胞群所在區域,進行活化分析。

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          除了與流式細胞儀配套的軟件之外,還有多種商業化計算機程序能夠用于流式細胞術數據的分析。目前,最常用的流式分析軟件有FlowJo、WinList、FCS Express、Kaluza和WinMDI。

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          細胞周期分析

          細胞周期分析軟件程序使用倍性建模來確定由 DNA 直方圖表示的細胞周期階段。ModFit LT是一個專門用于這類分析的程序。此外,FlowJo有一個細胞周期分析模塊。


          高維數據分析

          使用常規流式細胞術分析方法對高維數據進行分析是繁瑣的,會消耗大量時間,因為高維數據往往含有14個以上的參數。另外,使用常規的“門控”方法難以確定多個標記之間的關系,可能會導致目標細胞群的丟失。目前,已有多個新的分析工具可用于高維數據的分析以及可視化,比如SPADE (Spanning-tree progression analysis of density-normalized events),tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding),PCA (Principal component analysis),以及FLOCK (FLOw clustering without K)。算法上,tSNE與PCA相似,但是tSNE能夠比PCA識別出更多的共分離特性。tSNE可作為FlowJo和FCS Express的插件使用。

          此外,Cytobank是一個高維數據的云端分析系統,分析參數可達30個以上。在這里,用戶通過上傳數據并選擇相應的分析項目進行數據分析。Cytobank的聚類、降維和可視化工具充分利用云計算的可伸縮性,可快速進行大量分析。

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